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揭秘CRISPR“中心法则”,一图了解CRISPR系统作用全步骤!
2016-08-26 09:03   审核人:

2007年,科学家找到了一种能增强细菌防御噬菌体能力的方法。2013年,四个研究团队报告了这一被称为CRISPR的系统,自此CRISPR技术红红火火的发展了起来,许多科研团队利用它来删除、添加、激活或抑制人体、老鼠、斑马鱼、细菌、果蝇、酵母、线虫和农作物细胞中的目标基因。

20159月,来自蒙大拿州立大学的两位学者在国际生物学顶级期刊CELL上以“CRISPR-RNA-Guided Adaptive Immune Systems”为题,介绍了CRISPR-Cas免疫应答系统。其中Blake Wiedenheft就是当年加州大学伯克利分校Jennifer Doudna研究组成员,他们曾于2010年破解了Csy4核糖核酸内切酶原子水平的晶体结构模型——研究人员确定Csy4是一种存在于原核细胞的酶,它能够启动生成CRISPR衍生RNAs (crRNAs),这种小RNA分子能够靶向并沉默侵入的病毒和质粒。

 

 

1. CRISPR-Cas系统工作全景图

 

细菌和古细菌进化出了复杂的CRISPR适应性免疫系统,这一系统可以分成I-III三个类型,至少有11种不同的亚型:从I-AI-F,从II-AII-C,以及III-AIII-B,不过尽管有这些不同,所有的CRISPR-Cas系统都通过三个主要阶段来完成功能:采集外源DNACRISPR RNA(crRNA) 生物合成与靶向干扰。

 

阶段1:外源DNA采集

 

2. CRISPR-Cas系统行使功能的第一步——外源DNA采集

 

宿主通过Cas蛋白来识别外源核苷酸,入侵细菌的短片段DNA称为protospacers,它们作为间隔区序列插入到了宿主的CRISPR位点。在III型系统中,protospacers选择自入侵DNA旁出现PAM的区域(PAMprotospacer adjacent motif,对于CRISPR结合至关重要)。一般protospacers通过包含Cas1Cas2和游离3'-羟基等元件的机制连接在CRISPR位点的前导区(Leader)Protospacer的整合也伴随着末端重新序列复制,这可能涉及宿主聚合酶和DNA修复机制。

 

阶段2crRNA合成

crRNA的生物合成从转录开始,接下来是初级转录产物pre-crRNA加工生成一类短的CRISPR衍生RNAscrRNAs),每一个都包含与之前遇到的外源DNASpacer序列)对应的互补序列。crRNA导向序列的两侧是相邻重复序列区域。在I型和III型系统中,初始CRISPR转录产物会被CRISPR特异性核酸内切酶(Cas6 Cas5d)在重复序列位点内切割。在许多I型系统中,重复序列是回文结构的,Cas6可以稳定连接在crRNA 3'端茎环上。而在III型系统中,Cas6短暂与CRISPRRNA连接,crRNA 3'端会被未知的核酸酶进一步处理。

CRISPRRNA的加工在II型系统中依赖于包含一个与重复序列互补序列的反式作用 crRNA (tracrRNA)。这些双链的区域在Cas9存在时可以被RNaseIII加工,靶向干扰需要tracrRNA crRNA的同时存在。II型系统中的这两个RNAs可以融合成一个sgRNA,目前,II型系统是我们研究的“火力”较为集中的系统,而Cas9已经变成了在多种细胞类型和组织中靶向基因编辑的强大工具。

 

 

3. CRISPR-Cas系统行使功能的第二步——合成crRNA

 

阶段3:靶向干扰

4. CRISPR-Cas系统行使功能的第三步——靶向干扰

成熟的crRNAs指导Cas蛋白到互补靶标,靶序列由特异性的Cas核酸酶降解,但不同的CRISPR系统降解机制存在差异:I型和II型系统都可以靶向包含PAMprotospacer互补序列的dsDNA底物。在II型系统中,靶标的降解是通过单一的蛋白Cas9和两个RNAs来实现的,而在I型系统中,则依赖于包含多个亚型的复合物,可以结合dsDNA并招募Cas3Cas3是一个反式作用的核酸酶,经常融合到依赖于ATP的解旋酶上。类似于I型系统,III型系统也同样依赖于探测目标的多亚基复合物,这些复合物展示出了内源性核酸酶活性,依赖于转录方式降解互补的RNA、靶向DNA,不过III型系统不依赖于PAM进行靶标位点的识别,而是通过碱基互补配对,导向序列延伸至crRNA信号5'handle的核苷酸进行识别(CRISPR位点包含与导向序列,5'handle互补的序列),并阻止靶向裂解。

 

循环关闭

 

 

 

I型系统中,复合物靶向结合会导致Cas3介导的靶向降解(直接干扰)或最初采集,这其中涉及crRNA导向募集Cas3Cas1 Cas2到外源DNA处,引起新一轮的快速采集。II型系统中虽然未观察到最初采集,但Cas9protospacer正确筛选的必要元件,这表明在靶向干扰与外源DNA采集之间存在一种功能性联系。近期,多种可以产生anti-CRISPRs蛋白的病毒编码基因已经证明了可以干扰CRISPR的不同阶段,这将颠覆CRISPRs 系统。

(来源:生物探索 http://www.biodiscover.com/news/research/122589.html

原文阅读:SnapShot: CRISPR-RNA-Guided Adaptive Immune Systems

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